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益生菌在喷雾干燥过程中的活性变化与保护策略

更新时间:2009-03-28

益生菌是一类对人体健康具有有益作用的微生物的统称,世界卫生组织WHO将其定义为“在口服足量后,可以对宿主带来有益影响的活微生物”。目前常见的益生类微生物主要源自革兰氏阳性的乳酸杆菌属、乳酸球菌属、双歧杆菌属以及一些酵母,一些代表性益生菌包括厚壁菌门的杆菌如嗜酸乳杆菌 Lactobacillus acidophilus、植物乳杆菌 L.plantarum、鼠李糖乳杆菌L.rhamnosus、清酒乳杆菌L.sakei、副干酪乳杆菌L.paracasei、瑞士乳杆菌L.helveticus和德式乳杆菌亚种保加利亚乳杆菌L.delbrueckii ssp.bulgaricus,以及同样是厚壁菌门的球菌如乳酸乳球菌Lactococcus lactis、唾液链球菌亚种嗜热链球菌 Streptococcus salivarius ssp.thermophilus和屎肠球菌Enterococcus faecium,还有放线菌门的长型双歧杆菌 Bifidobacterium longum、婴儿双歧杆菌 B.infantis、乳双歧杆菌B.lactis和真菌界子囊菌门的布拉酵母菌Saccharomyces boulardii[1-6]。其中瑞士乳杆菌L.helveticus、保加利亚乳杆菌L.bulgaricus和嗜热链球菌S.thermophilus是乳品工业的发酵起始剂,广泛地用于生产酸奶或奶酪。

大部分益生菌均天然存在于健康人类的肠道,它们消化食糜中的营养进行新陈代谢,帮助分解食物中难以消化的组分,分泌对人体有益的代谢产物,抑制有害菌群的繁殖。据文献报道,益生菌对人体的健康作用包括缓解急性肠胃炎症状、改善慢性肠炎、缓解乳糖不耐症状等[1,4,6-7],近期发表在Cell、Science等一些顶级期刊中的文章指出,特定益生菌及肠道菌群在减少病原菌于肠内的定植和生长、提升免疫力、缓解神经发育障碍等方面也具备显著的作用[8-10]。在临床上,活性益生菌制剂已被应用于对急性腹泻、肠胃炎等疾病的辅助治疗中[11]。而直接移植健康人的粪便到重度腹泻病人的肠道,可以缓解长期腹泻的症状,该作用也被归因于粪便中的有益菌群[12]

益生菌对人体健康的促进作用,使它成为一种天然、绿色、可以日常服用的营养品,不仅在药剂市场上,在食品市场中也具有广泛应用,以益生菌饮品、益生菌酸奶等形式大规模出售。Transparency Market Research在2015年发布调研报告指出,由于消费者日益重视肠道健康,活性益生菌制剂的全球市场持续看涨,预计在2020年可达到960亿美元,而食品与饮料将成为主流市场;相较欧洲、北美和其他地区,亚太地区的消费有望持续领先[13]。Grand View Research在2016年发布报告称, 2015年益生菌的全球市场价值已经超过了350亿美元[14]。而国内现在对于健康饮食的重视,进一步扩大了益生菌食品的市场潜力。

十九大报告指出:建设生态文明是中华民族永续发展的千年大计。必须树立和践行绿水青山就是金山银山的理念,坚持节约资源和保护环境的基本国策,像对待生命一样对待生态环境。随着全球生态环境的恶化,绿色发展理念深入人心,企业碳信息披露这一课题也逐渐受到全球范围内学术界的广泛关注。

为长时间保存益生菌制剂中的菌体活性,药剂工业上通常采用冷冻干燥进行制粉。冷冻干燥通过先冷冻后升华的过程除去益生菌和菌体保护载体中的水分[15],过程中物料温度被控制在冰点或以下,在高真空下升华冰晶,被脱水的物料中并不存在气液界面,因此,微生物遭受的热胁迫、氧化胁迫以及水分移动的影响均为最小,能很好地保存菌体活性[16-17]。然而,冻干过程中冷冻与升华两步均需要大量的能量,若冻干工艺未臻优化,也会出现冷冻胁迫或物料崩塌等问题。此外,活益生菌本身价值较高,这些问题使成品益生菌制剂的价格比起其他保健型食品,如复合维生素片、复合矿物质片等,来得更为昂贵。而食品工业中常采用的液态产品形式,如益生菌饮品或冷藏酸奶,具有保质期短、运输不便等问题,同样限制了益生菌产品的市场规模。

为降低活性干益生菌制剂的生产成本,目前科研领域对喷雾干燥生产活益生菌干粉的可行性展开了广泛研究。喷雾干燥是食品和药剂工业中应用最广泛的制粉技术之一,制粉迅速、颗粒性能可控、生产能力高、可一步法制备微胶囊[18-21],相较冷冻干燥技术,它的生产成本低了6~50倍[19,22-23]。但喷雾干燥中采用的高气流温度与快速脱水过程可对益生菌造成多重胁迫,如热胁迫、脱水胁迫、氧化胁迫、颗粒收缩带来的机械力胁迫、高盐和高 pH造成的胁迫等[24-27],不当的干燥条件可造成高达几个数量级的菌体活性损失。目前已有一些文献报道,在优化的喷雾干燥条件下,益生菌的存活率可达到接近 100%[28-29],但这些结果通常局限于实验中所采用的喷雾塔,难以推广到普遍喷雾干燥过程。特别是在研究某一特定载体组分对菌活的影响方面,文献中常出现互不一致的结果。这些问题与喷雾干燥塔的结构与雾化液滴干燥的过程特征有关。本文对喷雾干燥生产活性益生菌干粉进行系统回顾,从雾化液滴在喷雾干燥过程中的动力学参数变化出发,着重讨论益生菌在喷雾干燥中所受的影响,并总结了能提升干燥后益生菌活性的综合方法。文中所探讨的益生菌活性,指益生菌样品在丰富营养培养基上进行涂布计数或倒板计数时,生长得到的菌落数量,以单位体积或单位质量的浓度进行表示。

  

图1 乳品工业中一个典型喷雾干燥过程的流程示意图

1 益生菌在喷雾干燥中经历的历程变化

1.1 雾化液滴的干燥动力学参数变化

除改变培养条件外,对培养好的菌株进行预处理,让它们经受一个亚致死量的胁迫,诱导应激蛋白如热休克蛋白的分泌,也是一个常用于提升菌株耐受性的方法。DESMOND等[65]发现,将副干酪乳杆菌L.paracasei在52℃处理15min后,所得菌体在 60℃热处理过程中的存活率可以提升 300~700倍,而在喷雾干燥后的活性可以提升18倍。对菌株进行高渗透压预处理也能提升细胞的耐受性,并具有对热胁迫的交叉保护作用[27,65]。而将在培养阶段已经提升过耐受性的菌株再进一步进行预处理,是否会出现协同保护作用,还是每株菌均有一定的耐受上限,到了上限则无法再进一步提高,像这样的问题目前还未有文献报道。解决这一问题,则有助于设计更合理的喷雾干燥工艺,生产高活性的益生菌干粉。

式中:P为块段中锆英石、或钛铁矿矿物量,t;V为块段体积,m3);C为块段锆英石或钛铁矿的平均品位,kg·m3。

在制备活性益生菌干粉时,进料液中益生菌与一种或多种保护载体混合,载体可以是溶解或悬浮固形物,在干燥后形成连续的固相体系包埋益生菌。料液经雾化后,液滴中的益生菌在很短时间内经历快速升温、脱水与颗粒成形等过程,液滴的干燥动力学参数变化,如液滴温度(Td)、液滴含水量(X)、温度变化速率(dT/dt)、水分变化速率(dX/dt)与干燥时间(t)直接影响干燥过程中益生菌的瞬时活性,也决定了颗粒出塔后所余有的活益生菌含量[33-35]。而这些参数的变化与载体材料的性质有关,同一塔体中不同材料的干燥动力学并不相同,在传统喷雾塔中很难追踪液滴干燥动力学变化的实时过程,因此也难以建立它与益生菌活性变化间的定量关系,不利于诠释载体材料与益生菌细胞间的相互作用。另一方面,当同一材料在不同喷雾塔中进行干燥时,两塔间雾化器和塔内空气动力学的差异也将影响雾化液滴的干燥动力学,使不同塔得到的结果相对难以进行比较。如图2所示,假设一个理想喷雾干燥过程,同样的进口条件,塔内温度场沿塔体高度均匀降低,同时雾化液滴如雨下落,在底部出塔。由于载体A的干燥速率快于载体B,还未接近出口,A的液滴已经完成干燥形成颗粒,在之后的干燥过程中,颗粒温度就会上升,益生菌活性受颗粒温度影响,特别是干燥表皮部分,就会持续降低;而载体B的保护性能略差于载体A,但它的干燥速率较慢,直至塔的出口才完成干燥,此时颗粒中益生菌的存活率已经高于载体A中的存活率。但若换成另一个喷雾塔,这个塔具备更强的干燥能力,A和 B两种材料间的干燥速率差异就不一定明显了,此时粉末出塔时载体A中益生菌的活性或许还会高于载体B。可见,要优化喷雾干燥后益生菌的存活率,应明确益生菌与载体组分间的相互作用关系,为每种载体设计合理的干燥方案与干燥工艺,开发高效配方载体;而研究干燥过程中益生菌活性的变化历程,将为这些问题提供实验数据,打下坚实的研究基础。

  

图2 干燥速率较快的载体A与干燥速率较慢的载体B在喷雾干燥过程中的温度变化简单示意图

 

(白色代表温度低,而灰色越深则温度越高)

1.2 益生菌活性在液滴干燥中的历程变化

HUANG等[67]采用高浓度(质量分数30%)的甜乳清来培养干酪乳杆菌Lactobacillus casei与费氏丙酸杆菌Propionibacterium freudenreichii,并在不更换载体的情况下直接喷雾干燥所得到的菌体培养液,生产活性益生菌产品。结果发现,像这样将甜乳清一物两用,既作为培养基也作为保护载体,可以有效地提升干粉中益生菌的活性,在实验室级别的喷雾塔和在小试级别的喷雾塔中,均可以达到100%的菌体存活率[67,71]。对高浓度甜乳清培养得到的费氏丙酸杆菌P.freudenreichii进行研究发现,菌体获得了对多重协迫作用的耐受性,表现为应激蛋白的表达、细胞内相溶性溶质的积累等[72]。DIJKSTRA 等[66]在培养乳酸乳球菌 Lactococcus lactis的研究中观测到了类似的趋势,通过改变培养温度、pH、氧气水平、盐浓度等培养条件,所得到的不同菌体对热胁迫与氧化胁迫的耐受性差了1000倍;进一步的全基因组转录组学分析显示,改变氧气含量与培养温度可以诱导更多的基因表达,如蛋氨酸与半胱氨酸新陈代谢的相关基因。

  

图3 玻璃纤维悬挂式单液滴干燥实验

对于Δt的两个解,根据实际抓取情况进行取舍,然后确定抓取位置和抓取路径。如果两个解全部符合要求,那么选择时间比较短的解;如果两个解全部不符合要求,那么将放弃对此工件的抓取同时做好漏抓记录。

在益生菌干燥实验中,可以在任一干燥时间停止 SDD实验,取样分析半干液滴中残余的菌体活性,在同样条件下重复干燥实验并逐步延长干燥时间,例如在图3(b)中显示的每一干燥阶段分别取样,所得的益生菌活性结果将组成该条件下菌活变化曲线,也称为失活历程(inactivation history)[35-36,50-51]。将菌体活性变化与 SDD实验测得的 Td、X、dT/dt及 dX/dt联系后进行分析,可以将复杂的液滴干燥动力学分解,明确单一干燥动力学参数对菌活的影响[35,37,51]。目前国内外有多个课题组采用SDD技术对益生菌的失活历程进行了研究。FU等[36]发现,即使采用70~110℃的高温进行干燥,在干燥前期,液滴的温度受蒸发冷却效应影响,维持在较低的区间(<40℃),此时液滴内乳酸乳球菌 Lactococcus lactis ssp.cremoris的活性基本能保持在初始水平。当干燥进入中后期,液滴温度迅速增高,益生菌活性出现一个明显转折,进入到快速失活阶段,说明液滴温度对益生菌的存活具有关键影响。GHANDI等[35]分析了乳酸乳球菌Lactococcus lactis的失活历程与所使用的干燥温度及载体组分的关系,他们指出,在较高的液滴温度(≥65℃)时,脱水胁迫与热胁迫均能造成菌体死亡,而采用保护性载体如乳糖或酪蛋白酸钠,则能有效地提升乳酸菌细胞的存活。KHEM等[50]提出,除了液滴温度的绝对值外,蛋白质类载体如乳清蛋白或脱脂牛奶在干燥过程中会较早成壳,使液滴的温度变化速率较为温和,有利于保护益生菌的活性。PERDANA等[46]则发现,在干燥气流温度小于45℃时,益生菌的失活主要由脱水胁迫导致,而在干燥温度高于45℃时,脱水胁迫与高温胁迫同时作用于菌体,导致菌活损失。总结这些研究结果得出,采用单液滴干燥实验,可以为特定载体建立液滴干燥动力学参数与益生菌失活历程间的关系,对载体中菌体的失活规律展开定量研究,对不同载体和菌细胞间的相互作用进行直接对比和分析。然而,一条失活历程的建立通常需要10个以上的独立实验,实验量较大,目前仍需要更多的数据积累,以进一步探明液滴干燥过程中益生菌活性受载体组分和干燥动力学参数的影响规律。

1.3 喷雾干燥中益生菌的亚细胞结构损伤与细胞功能性损伤

在喷雾干燥过程中,多种不利因素胁迫与液滴干燥动力学变化相互作用,可能会造成多个亚细胞结构或生化大分子损伤,如细菌染色体、核糖体、细胞膜、酶或其他可溶性蛋白质等[25-27]。研究具体的细胞结构受损,明确益生菌失活在细胞水平上的机理,从而有针对性地开发保护性载体,是目前的主要研究方向之一。

大力引导绿色共建。进一步完善重大项目环境影响评价群众参与机制,推动环境敏感性项目“邻避”论证。完善环境保护信息公开制度,建立环境保护信息公开平台。推进生态环保项目与社会资本合作,重点推介抚河流域综合治理等50个生态文明PPP项目。出台环保社会组织行为规范指导意见,引导社会各界参与环境保护。加强生态文明建设的宣传和舆论引导,建立环境污染问题媒体曝光、解决、处理、通报制度。

研究喷雾干燥中益生菌细胞结构发生的变化以及益生菌与载体材料间的相互作用,旨在明确益生菌活性丧失与活性保存的内在机理。在实际试验或生产中,具体到每一个独立的喷雾塔上,如何设定喷雾干燥的操作条件是提升干粉中益生菌存活率的关键。喷雾塔的主要操作条件包括喷嘴类型(压力式、超声式、离心式或双流体式)、空气进口温度、气流的风速、进料液的流量等[73]。参照1.1节中的讨论,这些操作条件直接影响雾化液滴的干燥动力学变化;即使两台塔采用相同的进口条件,但喷嘴的类型还有热空气在塔中的流动状态,也会导致干燥动力学的区别,进而影响益生菌的活性。因此,近期文献中逐渐着重于研究载体与益生菌的相互作用以及液滴干燥历程的影响,以期能建立适用于各种喷雾干燥塔的益生菌活性保存普遍规律;在此基础上,结合每一台塔自有的干燥动力学,建立干燥条件-液滴干燥动力学-菌体活性变化间的关系。

对于喷雾干燥条件的影响,文献中的普遍共识是,高出口温度对益生菌的存活具有负面影响[54,68,70,74];而出口温度受到进口温度[56,75]、气流流速[68]、进料液流量[76]等多个条件影响,无论调整哪个条件,升高出口温度均伴随着干粉中益生菌存活率的降低。因而,在能够得到干粉的前提下,喷雾干燥的出口温度越低越有利。这一规律与1.2节中SDD的研究结果具有一致性,在干燥前期,即使喷雾塔中的气流温度较高,但液滴中水分蒸发的冷却效应可以将液滴温度控制在一个较低的范围,有利于菌活的保存,而在干燥后期,半干液滴中的固相组分成为主导因素,颗粒温度逐渐接近环境温度,此时若外界的环境温度较低,则可以减少热胁迫导致的益生菌失活。因此,对于操作设置比较灵活的喷雾塔,可以通过改变雾化液滴的大小、空气进风的分布、进料液的流量,来降低出口温度。

在这几类SDD实验中,玻璃纤维悬挂式SDD能够对干燥过程中液滴的温度、直径与重量变化进行连续测量[图 3(a)],进而计算出 X、dX/dt、dT/dt等数据,这个优点使它在干燥动力学研究中有着最广泛的应用。它的实验机理如图 3(a)所示[43,47],在干燥室中用一根特制的玻璃纤维来悬挂液滴,玻璃纤维的直径从100μm逐渐缩小到30μm,在端部制成一个200~300μm的玻璃结,并覆以多层涂层以阻止液滴上移。在实验时,将一个直径为 0.98~2.48mm(0.5~8μL)的小液滴悬在玻璃纤维上,采用具有可控温度、湿度与风速的热气流自下而上地通入干燥室,进行干燥实验。液滴温度、直径与重量的变化分别采用不同的测量模块进行测定,温度由插入液滴内部的精细热电偶进行监控,直径由摄制的液滴投影面积进行测算,而重量是由一根特制的L型玻璃纤维进行测量,该玻璃纤维随着液滴的失水发生位移,位移距离与液滴重量成正比,通过记录干燥过程中玻璃纤维的位移变化,测定出液滴在干燥过程中的重量变化[43]。同时,也可以通过高清摄像机实时记录干燥过程中液滴的形貌变化,来对比不同料液组分对颗粒形成过程的影响[47-49]。图3(b)对比了脱脂牛奶、全脂牛奶和浓缩牛奶蛋白的液滴干燥与颗粒形成过程,3种乳品材料的液滴表面积变化具有较大区别,也许会影响干燥过程中的传热传质;另一方面,在干燥末期,3种乳品颗粒的形貌与颜色也出现了较明显的差异。这些结果为研究喷雾干燥过程中的液滴干燥历程提供了坚实的基础 数据。

在细胞功能性的研究方面,文献中常调查的功能性包括喷雾干燥后益生菌对消化液耐受性的改变[62-63]、益生菌表面的疏水性变化[17,64]、黏附性变化[28]以及生长能力的变化[57]等。由于活益生菌制剂需要口服,对消化道中严苛环境的耐受是它们到达肠道、定植并发挥益生作用的第一步。文献中通常认为,合适的保护载体有助于改善益生菌对于消化液的耐受性,特别是蛋白质和多糖类载体,表现出较突出的保护作用[62-63]。KHEM等[64]采用正十六烷萃取的方法,表征了喷雾干燥后益生菌表面疏水性的变化,他们提出,同样具有疏水集团的天然乳清蛋白,能较好地包埋益生菌,加强对菌体的保护。IACONELLI等[17]的研究显示,益生菌在干燥后表面疏水性的变化与它的免疫调节能力相互关联,而这些功能性的改变与益生菌活性变化并无显著关系。这也进一步说明了,具有亚细胞结构损伤的菌体也许能在丰富营养培养基上修复损伤继续生长,但可能会伴随着特定功能性的缺失。GOLOWCZYC等[28]研究了喷雾干燥后益生菌附着在 CaCo-2细胞上的能力,发现在亚细胞结构完整的情况下,细菌的附着能力也可以得到较好的保持。可见,在研究喷雾干燥生产活性干益生菌时,亚细胞结构与细胞功能性的完整也是至关重要的。

在细胞损伤历程的研究方面,ZHENG等[57]首次采用SDD对鼠李糖乳杆菌L.rhamnosus在液滴干燥中的亚细胞结构变化进行了研究。选用 NaCl与氯霉素作为选择性试剂,他们发现,随着干燥进行,亚细胞结构的受损略早于益生菌活性的丧失,在干燥后期,丰富营养培养基与选择性培养基上生长的菌落数出现了1.5~2个数量级的差别,说明亚细胞结构的损伤变得越发严重。而对干燥过程中益生菌生长能力的变化进行研究发现,同一种载体对菌活与再生长能力的保护效果并不相同;这个结果与之前IACONELLI等[17]在喷雾干燥中得到的结果是一致的。

“一带一路”为我国企业走出去带来了前所未有的新契机,正是因为前所未有,所以企业经验不足,缺乏相关的人才。现有的知晓国际税收的人才多数集中在大企业,中下层较少。同时,由于“一带一路”提出之前企业中懂得小语种的人才较少,或者是懂得的小语种种类较少,这也是走出去倡议中的绊脚石之一。面临这些挑战,国家与企业应该大力培养更多的人才,加强对相关领域人才的培训,引进更多新的人才。尽快培育出一批适应“一带一路”倡议需求的国际税收人才。

综上所述,目前对喷雾干燥中益生菌亚细胞结构与细胞功能性的损伤过程研究还相对较欠缺。文献中多在研究高保护性的载体材料或喷雾干燥工艺,分析不同材料对干燥后菌体活性与功能性的影响,从食品化学方面探求载体保护作用的主要机理。

2 提升喷雾干燥后益生菌活性的主要途径

总结文献中提升喷雾干燥后益生菌活性的主要途径,大致可归为3类[57]:①提升益生菌自身对不利环境因素的耐受性[65-67];②优化喷雾干燥条件,得到更高的干菌存活率[56,68];③采用保护性载体及配方载体,加强对菌活与细胞结构的保护[45,69]。以下就这3个方面分别进行探讨。

夹具误差由夹具定位元器件制造缺陷引起,用夹具位置坐标相对机床位置坐标的偏差表示。如图4所示为3-2-1定位夹具,夹具的6个定位元件限制工件在空间中的6个自由度,使工件被完全定位。夹具位置由6个定位元件在夹具坐标系的位置表示,夹具误差表示为夹具的6个定位元件上的偏差,分别定义为:夹具f=[l1z,l2z,l3z,l4x,l5x,l6y];夹具偏差Δf=[Δl1z,Δl2z,Δl3z,Δl4x,Δl5x,Δl6y]。

2.1 提升益生菌自身对于不利环境因素的耐受性

不同种属的益生菌在经受热处理、干燥处理或其他处理后,可表现出不同的死亡率,说明不同种属的益生菌对于不利环境因素的耐受性有所区别,影响喷雾干燥后干菌的存活率[54,68,70]。即使是同一种属的益生菌,不同菌株对环境胁迫也有不同的响应,例如同样是鼠李糖乳杆菌L.rhamnosus,在相同的喷雾干燥条件下,菌株GG的存活率普遍高于菌株 E800 [55-56];双歧杆菌属的菌株也表现出了类似的特性,同为婴儿双歧杆菌 Bifidobacterium infantis或长型双歧杆菌Bifidobacterium longum,在相同条件下进行喷雾干燥,存活率可出现2倍的差别[69]。事实上,同一株菌的耐受性也会随着培养条件或载体环境的变化而改变,因此在喷雾干燥之前,应合理地选择益生菌的培养条件,或加入一些对菌体的预处理,以增强菌体自身对喷雾干燥中各种不利环境因素的抗性。

为解决喷雾干燥塔中难以追踪液滴干燥动力学变化的问题,文献中通常采用单液滴干燥实验(single droplet drying,SDD),在可控的气流条件下,研究单一液滴随干燥进行所发生的动力学参数变化,同时对过程中益生菌的活性变化历程进行实验测定,从而为每一载体建立益生菌失活与干燥动力学变化间的定量关系[34-37]。FU 等[19]将文献中常报道的SDD实验总结为3类,依照干燥过程中支撑液滴的方式不同,分为自由下落式(free falling SDD)[38-39]、超声场支撑式(acoustic levitation SDD)[40-41]、与玻璃纤维悬挂式(glass filament SDD)[42-43]。SDD实验为液滴干燥与颗粒形成过程提供定量数据,是研究干燥过程中复杂物理、化学或生物变化的基础。近年来,越来越多的SDD和变体SDD实验在科研中得到应用,如将孤立液滴倒悬在一个平面上,研究液滴干燥过程中的表壳形成[44],或者将孤立液滴放置在一个疏水平面上,研究益生菌与载体间的相互作用[45-46]

图1展示了乳品工业中的一个典型喷雾干燥过程(绘图参考GEA集团的Nozzle Tower TM喷雾干燥塔系列)。经过浓缩、均质等前处理的料液(也称为前驱液)通过泵从塔顶进塔,经由雾化器雾化形成数以亿计的小液滴;同时,空气在除湿和加热后从塔顶进塔,对雾化液滴做顺流干燥[20]。由于进口空气温度可达到130~200℃,而微米级液滴具有较大的表面积/体积比,雾化液滴中的水分迅速蒸发,形成干颗粒,干燥过程可在几秒至几十秒内迅速完成[30]。所形成的干颗粒一部分进入袋式过滤器,与空气分离后进入二级干燥的流化床,另一部分直接进入流化床干燥器,作进一步除水、团聚,形成成品粉末。也有些喷雾干燥过程会省去流化床二级干燥,让喷雾干燥的颗粒经由袋式过滤器收集后直接出塔。取决于产品特性和对生产能力的需求,不同喷雾干燥系统所采用的雾化器种类与每小时处理能力以及热空气的进风量相差较大[31],工业级别大型喷雾干燥塔的产量可达到每小时几百千克甚至上吨;而经过精巧设计的喷雾干燥塔,也能对几十至几百毫升的少量前驱液进行喷干制粉,常用于制药行业对于活性药剂成分进行初筛[32]

834 Research status and application prospect of artificial intelligence technology in lung tumors

2.2 优化喷雾干燥条件以降低环境胁迫的影响

由于在喷雾塔中较难以展开历程研究,目前研究细胞损伤的常见方法是对干燥后粉末中的益生菌进行表征。一种用于表征不同部位细胞结构损伤的传统方法是采用选择性培养基对干益生菌进行培养[28,37,52-53],带有可逆性损伤的益生菌在丰富营养培养基如 MRS上能够修复损伤继续生长,但会表现出对特定试剂的敏感性。也就是说,在健康细胞可以正常生长的试剂剂量下,细胞结构上带有损伤的益生菌却会受到生长抑制,而不同细胞结构受损的益生菌会表现出对不同试剂的敏感性。例如,细胞膜受损的益生菌将表现出对 NaCl的敏感,蛋白质合成功能受损的益生菌将表现出对氯霉素的敏感,肽聚糖合成功能受损的益生菌将表现出对青霉素的敏感等[52]。因此,通过测试干燥后益生菌对不同试剂的敏感性,可以判断菌体中受损的细胞结构。多个课题组的研究发现[53-56] ,对于副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei、唾液乳杆菌 Lactobacillus salivarius、玉米乳杆菌Lactobacillus zeae、罗伊氏乳杆菌 Lactobacillus reuteri与鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus等多株乳酸菌,即便能在喷雾干燥后保持高活性,都会表现出程度不一的细胞膜损伤,具体损伤程度与所使用的菌株、喷雾干燥条件以及载体都有关系[53-54,57]。干益生菌所带有的细胞膜损伤可能会加速菌体在后期储存过程中的衰亡,因此,优化喷雾干燥条件并采用合适的细胞膜保护载体,对于提升干益生菌的存活及促进功能性的长期保持是非常关键的。另一方面,GOLOWCZYC等报道[28],在优化条件下,植物乳杆菌L.plantarum CIDCA 8311和两株高加索酸奶乳杆菌 Lactobacillus kefir在复原脱脂奶载体(reconstituted skim milk,RSM)中进行喷雾干燥后,并没有出现显著的细胞结构损伤,在加入了NaCl、溶菌酶、青霉素、胆汁盐的不同选择性培养基上,得到的活细胞数量与喷雾干燥前的数量基本保持一致,说明在合适的干燥条件下,益生菌的活性与亚细胞结构均可以得到较好的保持。

另一个常用的细胞活性表征方法同样基于细胞膜损伤,通过Live/Dead荧光染色的方法,用细胞膜的完整程度来判明菌体的存活。这个方法通常采用一种或两种荧光探针对干燥后的益生菌细胞作染色,关键的碘化丙啶(propidium iodide,PI)仅能穿过受损的菌细胞,将细菌染色体染色后,受激发发射出红光,而另一种对照染色剂通常采用Syto9,可穿过完整的菌细胞,与染色体结合后受激发发射出绿光;之后,通过荧光显微镜或荧光强度测试等表征,来判明干燥粉末中活细胞与死细胞的百分比[58-60]。PERDANA等[58,61]建议,这种方法可以与涂布平板计数法结合使用,对于一个数量级内的益生菌失活,可采用荧光染色法进行研究,而对于更高数量级的益生菌失活,则采用平板计数法。用Live/Dead荧光法表征出的活细胞与死细胞比例有时与涂布平板计数法并不一致,一方面说明了带有可逆细胞膜损伤的益生菌在丰富营养培养基上仍有可能继续生长,另一方面也说明了在喷雾干燥过程中,存在其他亚细胞结构受损,导致菌体失活。除了对细胞膜损伤的研究外,目前喷雾干燥生产益生菌粉末的文献中仅有少量涉及到其他亚细胞结构的表征,如细胞膜的氧化程度、酯酶活性、核糖体活性、新陈代谢活性等[17,59]。未来在这方面的研究,有助于在细胞水平上揭示导致益生菌失活的主要机理,从而有针对性地开发高效保护载体。

我国学者对社会动员的认识差异主要体现在动员的主体上,有的学者认为社会动员与政治动员是对立的,社会动员的主体为政府以外的社会力量;有的学者认为社会动员包含了政治动员。我国目前的社会动员主体以政府为主,社会力量为辅。但校园突发事件的社会应急动员主体应为教育部门和政府,其中政府起协助作用。校园突发事件应急动员的目的是为了解决学校的突发事件,学校领导更了解学校设施、资源和工作人员,有更多的主动性和导向性。政府协助学校能更有效的动员社会力量。因此,有效的校园突发事件应急动员机制需要以学校为主体,建立政府协助和全校师生员工、社会成员积极参与的机制。

喷雾干燥塔出口温度与益生菌存活率间的这一关系进一步提示了,为保证较低的出口温度,若所得颗粒中的水分含量过高,达不到干粉的质量要求标准,可以尝试两步干燥的方法,第一步采用喷雾干燥形成颗粒,实现移除大部分水分的目的,第二步采用较温和的干燥方式如流化床干燥,移除颗粒中的残余水分,最大化地保存干粉中的菌活。目前已有一些课题组对这种多级干燥制备活性干益生菌展开研究,并取得了接近100%的菌活保存率[71,77]

2.3 采用保护性载体提升益生菌的存活率

喷雾干燥载体对保存菌活的重要性目前已得到很高的重视,与冷冻干燥保护剂类似,合适的载体不仅能提升干燥后益生菌的存活率,同样也能保护益生菌在储藏过程中的活性,并帮助提高菌细胞对消化液的耐受性。需要指出的是,也许因为存在喷雾干燥历程的影响,也许因为不同菌株与载体间的相互作用有所区别,目前文献中对一些载体的保护作用尚未达成完全一致。例如,KHEM等[64,78]报道说,天然乳清蛋白对益生菌具有较好的保护作用,原因是乳清蛋白分子中的疏水基团与菌体表面间存在疏水作用,使蛋白质分子紧密包裹于细胞表面,从而在喷雾干燥中更好地保护菌细胞,而天然乳清蛋白的保护效果要优于变性乳清蛋白。然而其他研究结果显示[62,79],变性乳清蛋白的保护作用优于天然乳清蛋白,并将原因归结于在颗粒形成的过程中前者更早地成壳,因此能起到更好的保护作用。LIU等[53]发现,往酪蛋白酸钠载体中加入低熔点的脂肪有助于提升益生菌的存活率,减少菌体损伤。然而,ZHENG等[37]采用 SDD技术表征了鼠李糖乳杆菌L.rhamnosus在不同乳品材料中的失活历程,结果发现,菌体在全脂牛奶载体中的失活要显著地早于脱脂牛奶、乳糖以及乳糖与MRS培养基复合载体,他们认为,全脂奶中高含量的牛奶脂肪也许是导致菌体出现提前失活的主要因素。此外,文献中对海藻糖trehalose的实际保护效果也存在争议,海藻糖是多种生物面临脱水胁迫时由机体分泌的保护性双糖[80],目前学界中认为它的保护作用主要来源于两点:①它可以在生物组织脱水时替代水分子,保持生物大分子的结构不因脱水而剧变(图 4)[81];②它在干燥状态具有较高的玻璃态转化温度,因此形成的干颗粒通常处于无定形态,对比处于结晶态的其他糖类,无定形态的高黏度可限制有害化学反应的发生[80,82]。但当海藻糖被用作喷雾干燥生产活性益生菌的保护载体时,一些研究指出,它的保护作用非常有限[50],在干燥过程中液相中的海藻糖无法与生物大分子发生作用以替代被脱除的水分子[83];另外一些研究称,相较别的单糖或双糖,海藻糖的保护效果仍然很突出[45,57]。虽然文献中对于特定载体的具体保护作用尚未能完全一致,但总结其中提出的载体保护机理,再结合作者课题组最新的研究成果,将喷雾干燥载体对益生菌可能具有的保护作用归结于3个方面[57]:①提高亚细胞结构的稳定性,从而改善菌体自身的耐受性;②紧密包埋菌体形成物理屏障,从胞外作用减少菌体的损伤;③载体自身的液滴干燥动力学更适宜于益生菌的存活。

  

图4 细胞组织脱水时海藻糖的“水替代”保护作用机理图[81]

 

a—为海藻糖替代磷脂分子间的水,维持细胞膜的结构与流动性;b—没有保护剂时磷脂分子间距离缩短,发生相变,影响细胞膜流动性

在第1个保护作用方面,在含有特定载体材料的环境中,益生菌的一些亚细胞结构可变得更稳定,使细胞对不利胁迫的耐受性变好,可表现为在脱水过程中,亚细胞自身结构或该结构的活性更加稳定,如核糖体活性、新陈代谢活性等。海藻糖是一个具有此类保护作用的典型材料。有研究汇报,通过改变酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的培养条件,使细胞内积聚海藻糖,所培养得到的酵母在真空干燥和冷冻干燥后都表现出更好的存活率[84]。另有研究报道,海藻糖可以在热胁迫下保护酵母核糖体等亚细胞结构的稳定性[85],也有助于对抗氧化胁迫造成的细胞膜脂质过氧化[86]。一些近期的研究发现,二价阳离子,如钙离子和镁离子也能够提升益生菌对热胁迫的耐受性[57,87-88]。HUANG与 CHEN[87]往纯乳糖溶液中加入钙离子作为载体,多株益生菌在热处理后的存活率都出现了显著上升。ZHENG等[37]采用SDD技术,研究了在乳糖与海藻糖溶液中加入钙离子对益生菌失活与细胞膜破损历程的影响;结果发现,在乳糖加钙载体中,益生菌的活性得到提升,而菌体在液体培养基中的再生长能力也变得更好;而往海藻糖中加入钙离子则没有起到明显的保护作用,益生菌在纯海藻糖载体中的再生长能力反而更好;由此他们推测,钙离子的保护作用也许与海藻糖类似,都能够稳定亚细胞结构,虽然二者具体作用的部位也许并不相同。至于镁离子的保护作用,传统上认为它可以在热胁迫中稳定细菌的核糖体[89]

第2个保护作用来自载体材料自细胞外对菌体实现保护,多用于解释蛋白质特别是牛奶蛋白的保护机理。这种理论认为,特定载体材料能在细胞表面形成一层或薄或厚的紧密包覆,由此缓解外界不利因素对细胞的影响。图 5(a)中示意了益生菌细胞在常见液态载体中与载体固形物间的关系,与之形成对比的是图5(b)中的益生菌细胞,表面上有一层载体材料的紧密包覆[90]。考虑到益生菌的细胞特性与液滴干燥过程的特点,这种保护作用也许对保存菌体活性具有较重要的影响。在干燥过程中,水分蒸发导致液滴收缩,紧密包覆在益生菌细胞外的载体也许能在收缩过程中支撑细胞,维持胞体的完整性。同时,水分蒸发会带来胞外盐浓度增高、pH改变等不利因素,而这一层表面包覆可构成一层缓冲层,适当减缓这些不利胁迫对细胞内部的影响。HUANG等[90]往脱脂牛奶中加入钙离子,再通过加热来诱导牛奶蛋白变性,实现蛋白质凝聚,结果发现,在这样的载体中对益生菌进行热处理,菌体存活率对比未处理的脱脂牛奶出现了约两个数量级的提升。WANG等[51]采用SDD技术,以钙凝聚牛奶、加钙牛奶以及普通脱脂牛奶作为干燥载体,研究了3种载体中益生菌的不同失活历程,发现钙凝聚牛奶作为干燥载体也具有优秀的保护作用。在实际喷雾干燥中,KHEM等[64,78]将分离乳清蛋白对于益生菌的保护作用,也归结于蛋白质分子与细胞表面通过疏水作用实现的紧密包埋。

  

图5 益生菌细胞在含有溶解或悬浮固形物的液态载体中的状态

第3个保护作用则考虑了1.1节中所讨论的喷雾干燥过程中液滴的干燥动力学变化。雾化液滴中所含溶解或悬浮固形物的材料特性对液滴的温度变化、重量变化和直径变化具有重要影响,而直径变化会改变液滴的表面积,也将影响液滴与热空气间的传热与传质。图6比较了乳糖、脱脂牛奶和全脂牛奶在液滴干燥中的温度变化历程以及温度变化速率的改变[37],这些干燥动力学参数都会影响益生菌的存活(液滴大小为2μL,干燥温度为90℃,初始载体浓度为质量分数 10%)。文献[91-93]中研究了热处理过程中温度变化速率与渗透压变化速率对热处理后益生菌存活率的影响,结果显示,对于乳酸菌和酵母,都存在一个能够让存活率最大化的变化速率,整体趋势是,变化率越慢,益生菌的存活率越高。然而,过慢的变化率会使益生菌在升温后期的较高温区间停留过长时间,反而又会降低存活率。在实际喷雾干燥中,LIU等[53]往酪蛋白酸钠中加入占总固体含量为 10% 的低熔点脂肪,可以提升干燥后益生菌的存活率,他们把原因归结于低熔点脂肪在干燥过程中会发生相变,由于相变热会吸收一部分热量,更有利于益生菌的存活。

  

图6 复原脱脂牛奶、复原全脂牛奶与乳糖3种乳品材料作为益生菌干燥载体时液滴温度及变化速率的改变

由此可见,目前针对喷雾干燥载体提升益生菌活性的机理已经有了一定解释,反而是在具体材料的保护效果上存有争议,这些差异可能源自文献中使用的不同喷雾塔,也可能源自所使用的不同益生菌的生物特性。在之后的研究中,可以进一步明确不同载体的保护机理,探明载体材料与益生菌细胞间的作用关系,从而研发可在工业中应用的载体体系与喷雾干燥工艺。在评价载体效果方面,文献中发现,采用 RSM 作为载体时,益生菌通常具有最高的存活率,高于淀粉、麦芽糊精、乳清渗透物等载体[29,69,94]。因此,可采用RSM作为一个基准进行比较,研发保护效果优于RSM的载体或配方载体。

3 结语

基于益生菌在促进健康方面的口碑,使用喷雾干燥制备活性益生菌制剂成为相关产业的研究热点之一。本文主要回顾了在喷雾干燥过程中影响益生菌活性变化的主要因素,并分析了目前常用来提升干燥后益生菌活性的几种方法。综合而言,提升干益生菌活性,需要考虑菌种培养、载体设计、干燥条件等多方面因素,是一项结合了微生物学、食品化学、喷雾塔设计与仿真以及塔内传热传质的系统工程,特别是在干燥条件的选用方面,应针对每个具体的塔来设计工艺方案,以实现最高的存活率。在研究方面,需要考虑到的因素从构成益生菌的生化大分子层次和益生菌的细胞结构层次,到液滴干燥过程中的液滴干燥动力学和颗粒形成,再到设备设计、工艺优化等生产层次,是一个典型的多尺度化工问题,在每一层次上,有不同的工程与科学问题拟待解决。未来的研究中,一方面可以继续载体方面的研究,依据载体材料与益生菌间的相互作用关系,合理设计高效配方载体,揭示干燥动力学和益生菌失活间的影响规律;另一方面,也可以研发类似于双重用途高浓度甜乳清这样的新型工艺方案,既大大简化喷雾干燥的流程,又很好地保存了益生菌的活性。进一步针对喷雾干燥塔内益生菌失活历程的系统仿真,将更好地实现工业级喷雾干燥过程中益生菌活性的保存。

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傅楠,陈晓东
《化工进展》 2018年第05期
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